کلونینگ شکل جدیدی از فعال کننده پلاسمینوژن انسانی نوترکیب در سیستم یوکاریوتیک

پروتئین فعال کننده پلاسمینو‍‍ژن ( tpa) به عنوان عامل ترومبولیتیک برتر جهت درمان بیماریهایی نظیر انفارکتوس میوکارد حاد شناخته شده و امروزه بهبود ویژگیهای فارماکوکینتیک آن مورد توجه قرار گرفته است. reteplase(k2s) مشتقی از مولکول tpa می باشد که نیمه عمر و مقاومت آن به مهارکننده نسبت به مولکول tpa طبیعی افزایش چشمگیری را نشان می دهد. در این تحقیق هدف اصلی کلونینگ و بیان فرم k2s ژن tpa در سیستم یوکاریوتیک leishmania tarentolae می باشد که جدیداً به عنوان میزبان مناسب جهت کلونینگ و بیان ژنهای یوکاریوتیک معرفی شده است. کاست بیانی واجد فرم k2s از پروتئین tpa همراه با توالی signal sequence حاصل از اسید فسفاتاز ترشحی لیشمانیا و دو قطعه از لوکوس زیرواحد کوچک ریبوزومی rrna که در نوترکیبی همولوگ مورد نیاز است طی پروسه الکتروپوریشن به داخل سلولهای l. tarentolae وارد گردید. تست pcr تشخیصی ادغام کاست بیانی k2s در سایت 18srrna را نشان داد. تست زیموگرافی روی سوپرناتانت کشت سلولهای ترانسفکت l .tarentolae نشان داد که این سلولها قادر به تولید پروتئین نوترکیب k2s به صورت خارج سلولی با فعالیت سرین پروتئازی مناسب خود می باشند و بنابراین مشخص شد که پروتئین rk2s تولید شده در سلولهای l .tarentolae از لحاظ بیولوژیکی فعال بوده و در این سیستم فولدینگ مناسب خود را یافته اند. با توجه به این که محیطهای کشت این سیستم بیانی یوکاریوتیک ساده و ارزان قیمت می باشد و همچنین نتایج این تحقیق نشان داد که l .tarentolae می تواند به عنوان یک سیستم مناسب جهت تولید rk2s مورد استفاده قرار گیرد، لذا می توان امید داشت که با تولید و بهینه سازی بیان rk2s در این سیستم بتوان هزینه تولید این دارو را به حداقل رساند.